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科研流式细胞实验中关于荧光染料的选择因素

时间:2022-08-05    阅读:550    点赞:0

荧光主要的激发光与发射光谱主峰之间的差异称为stokes shift(斯托克位移), 常见的stokes shift不超过几十纳米。实验中分子发荧光:先要吸收光能,使电子跃迁到较高能级或激发态,当电子释放部分或全部光能时,就会发出荧光。失去的激发能是非辐射性的,失去的能量低于吸收的能量。

星戈瑞荧光stargraydye提供花菁染料、罗丹明、BDP、荧光素、近红外一区/二区染料、荧光探针、荧光标记蛋白/糖等。以下小星简述如何选择合适的荧光染料:

1、 确定荧光染料本身所适合的流式细胞仪,需要了解染料的激发波长和发射波长、仪器所配制的检测滤光片和激发光源。

2、 了解荧光素的相对荧光强度:相对荧光强度反映的是荧光素-单抗结合物的亮度,其判断标准是染色指数。

影响相对荧光强度的因素包括:不同仪器的激光及滤片组合不同,荧光素的相对荧光强度不同;抗体上荧光素分子的多少会影响相对的荧光强度。

3、 选择原则:

(1) 考虑抗原的密度:高密度表达的抗原可考虑选择几乎所有的荧光素;低密度表达的抗原需要可提供较高S/N比值的荧光素,如PE/APC。;     

(2) 自发荧光:每种细胞群都有不同水平的自发荧光,所有的荧光通道均可观察的自发荧光,但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞,选择发射波长长的荧光素(APC)可得到较好的S/N比值,对于自发荧光强度弱的细胞,发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善,可选用FITC。

(3) 非特异性结合复合染料:避免信号衰退。复合染料因为光、固定剂或温度升高会导致信号衰退,使复合染料在上一级染料处发光。

减少样本暴露于光、高温或固定剂,可很大程度上避免这一问题。若样本需要固定,要选择稳定的固定剂,可有效阻止复合染料的信号衰退。尽量减少信号间的干扰,检测的颜色越多,面临的信号干扰越多,选择试剂时尽可能降低荧光发射波长间的重叠。


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