一、 了解流式细胞仪激光器和滤片配置
在开始设计多色流式细胞术组合前，需要确定：(a) 激光的数量和类型、(b) 检测器的数量以及 (c) 适用于所用流式细胞仪的滤光片类型。根据这些条件确定要使用的荧光染料类型。
荧光染料的激发波长需要与可用的激光匹配。同时，荧光染料的激发波长还需与可用的滤光片匹配，并且要考虑滤光片可允许通过的波长。
二、 预估细胞样本、抗原和荧光染料的搭配
某些细胞群很罕见，或由于功能差异以及受细胞活性水平的影响抗原浓度较低。一般来说，这种情况应使用最亮的荧光染料。例如，PE 通常用于抗原表达水平低或表达情况不明的靶标，以及/或罕见的细胞群。针对抗原表达水平高的靶标则应使用更暗的荧光染料，例如 PerCP。应该注意的是，荧光染料的亮度会受到多种因素的影响，例如所用缓冲液以及流式细胞仪类型。
三、 避免光谱重叠
若需选择光谱重叠较少或没有光谱重叠的荧光染料，就不能选用最亮的荧光染料。但是，为避免荧光泄露，可以适当牺牲检测器中的亮度。
四、 设置好对照物
对照物包括未染色的细胞、活/死细胞标记物、单染阳性对照以及荧光扣除对照 (FMO)，这些对于复杂的多色套装至关重要。
五、 调节抗体浓度降低非特异性结合
抗体浓度不佳会增加非特异性结合，或降低测定灵敏度。因此，所有抗体都应进行滴定，以确定最佳的信噪比。
