染料可以被一定宽度波长范围内的光激发，染料激发时最高吸收峰波长就是激发峰，同样发出的荧光也是一个宽泛范围的荧光，最强的荧光波长即是发射峰。染料用激发峰波长的光照射时荧光最强，同样，在发射峰左右检测光信号时，最明亮最灵敏。每种染料都有特定的Ex/Em值，但是在不同溶剂（水溶剂 vs 有机溶剂）中，测得的Ex/Em值可能会不一样，另外不同仪器上测量可能会有轻微偏差。
如何确定荧光激发波长/发射波长？
荧光光谱分为：激发光谱（PLE）和发射光谱（PL）。
激发光谱：固定发射光的波长，改变激发光的波长，记录荧光强度随激发波长的变化。发射光谱：固定激发光的波长，记录不同发射波长处荧光强度随发射波长的变化。
无论是激发还是发射荧光光谱图，其都是记录发射荧光强度随波长的变化。所以荧光光谱中纵坐标为强度，横坐标为波长。首先从图中能获取峰位和半峰宽。峰位的直观体现是荧光的颜色；半峰宽则表示荧光的纯度。
因此可以根据这种荧光素的激发谱线来确定其激发波长，根据其发射谱来确定其发射波长。
激发谱：不同波长的光激发荧光素后，荧光强度的变化。
发射谱：同一波长的光激发荧光素后，各波长下的荧光强度的变化。
一般都取峰值。
其发射波长会随激发波长变吗？
对不同材料来说不同，绝大多数情况下，发射波长会随着激发波长的偏移而有所偏移。 对于固态物质，主要是因为分子与其它材料形成了π建，对于量子点溶液，激发波长也会显著导致发射光谱的不同。 但是不是绝对的，比如对于Alex555分子，发射波长的偏移往往就相对较小，这是由于分子内部的能带结构所决定的。
