适用于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光素（FITC），四乙基罗丹明（RB200）和四甲基异硫氰基罗丹明(TMRITC)。目前应用常见的为异硫氰酸荧光素。
以下stargraydye小编以异硫氰酸荧光素(FITC)为例，简要介绍抗体的荧光素标记方法：
基本原理：
许多蛋白质表面含有较多的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC共价结合。与FITC结合的抗体可用为特异性的探针，以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值为0.85），且形成的偶联物的稳定性很好，FITC是目前应用最广的荧光染料。
在pH 9.8条件下，赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应，由此形成硫脲连接。
标记方法：
异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种：
1、 搅拌法(适合大样品)
取一定量的纯化后的IgG溶液，用0.5 mol/L pH9.8碳酸盐缓冲液稀释至20 mg/mL。
按荧光素与抗体比1︰20~1︰100(一般用1︰100)称取异硫氰酸荧光素，用pH9.8碳酸盐缓冲液溶解。
将IgG溶液置于电磁搅拌器上，启动开关，轻轻搅拌，以不起沫为准。逐滴加入荧光素液(约10min~15min加完)。实验过程中，随时测定搅拌液的pH值，若低于9.0，则应以碳酸钠溶液调整。置4 ℃搅拌6 h～12 h即可。
2、 透析法（适合小样品）
IgG溶液用0.5 mol/L pH9.8碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度，装入透析袋中。
将荧光素配成0.1 mg/mL，其量为1%抗体溶液的10倍，装入烧杯中。
将透析袋置于烧杯中，放电磁搅拌器上4 ℃搅拌24即可。
透析法的优点是标记均匀，非特异性荧光少，但所标记的时间长，荧光素的用量多，约比搅拌法多10倍。
3、 标记抗体的纯化：
标记后溶液是一个混合体，它包括蛋白质与荧光素的结合体，游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体，则只需去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体，则要去除过度标记的抗体。对于某些特殊要求的组织染色试剂，则必须经过仔细的处理。
1）去除游离的荧光素
透析法：将标记好的抗体放入透析袋中于0.01mol/L pH7.6 PBS中或生理盐水中4℃透析数天，每天多次换液，直至透析液中无游离色素为止。通常约需5～7天才能透析完毕。
凝胶过滤：以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。该方法速度快，一般1h~2 h即可完成。也可以先透析4h~5h，让去除大部分游离荧光素，再过G25或G50柱。
2）去除过度标记的蛋白质分子
可采用DEAE—纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行，具体方法如下：
以0.01mol/L pH 7.6 PBS液洗脱。
以0.01 mol/L pH 7.6 PBS液(0.05mol/L NaCl)洗脱。
以0.01 mol/L pH7.6 PBS(0.1mol/L NaCl)洗脱。
以0.01 mol/L PH 7.6 PBS(0.2mol/L NaCl)洗脱。
4、 标记抗体的质量检测
用标准免疫荧光染色试验测定偶联率，或用F/P值对FITC标记质量进行鉴定：
取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，计算其F/P值。F/P值约高，说明分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定的标本荧光抗体以F/P=1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜。
注意事项
1、 偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平。
2、 FITC易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存。
3、 如果FITC-复合物对PBS透析不充分，可能会对免疫荧光染色产生干扰。
