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科研实验中的免疫标记技术-辣根过氧化物酶(HRP)标记

时间:2023-03-06    阅读:1533    点赞:1

常见的抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等,还有一些其他的标记方法例如金标记,星戈瑞荧光stargraydye简要介绍辣根过氧化物酶(HRP)标记:

辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。

为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。

标记方式:

(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液,混匀,盖紧瓶塞,室温避光作用2小时。

(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。

(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水,或纯化单抗等(15mg/ml),混匀。

(4)称取Sephadex G25干粉0.3g,加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧,室温作用(避光)3小时或4℃过夜。

(5)用少许PBS将交联物全部洗出,收集洗出液,加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液,混匀,室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液,混匀,室温作用1小时(或4℃过夜)。

(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化,分管收集第一峰。

(7)酶结合物质量鉴定:


克分子比值测定

酶量(mg/ml)=OD403×0.4

IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62

克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体,标记率一般为0.3-0.6,即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上,标记率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4时,E/P约为1。

标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性,抗体活性及效价、特异性。

(8)HRP抗体结合物的保存:加入等量甘油后,小量分装-20℃存放,防止反复冻融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否则会影响酶活性。必要时冻干保存,以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

 


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