FITC简介
中文名称：异硫氰酸荧光素
外文名：Fluorescein isothiocyanate isomer I 别称：异硫氰酸荧光橙红，异硫氰酸荧光黄，异硫氰酸荧光红，异硫氰酸荧光素异构体I，5-异硫氰酸荧光素
化学式：C21H11NO5S
分子量：389.39
CAS登录号：27072-45-3
熔点：>360 °C
水溶性：易溶于水和酒精溶剂
外观：黄色或橙黄色结晶粉末
应用：荧光素（常用于蛋白/抗体的标记）,在细胞表面抗原检测及细胞凋亡检测中应用。
FITC标记抗体的原理
在碱性条件下（pH8.5以上），FITC的异硫酸基在水溶液中与免疫球蛋白的赖氨酸r氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个Ig分子上能标记15~20个FITC分子。
FITC标记抗体的方法
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
FITC标记抗体的过程
Marsshall法，其材料和方法及步骤如下：
1、材料：
抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25~50mL）、冰及冰槽（或1000mL烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透吸袋、玻棒、棉线及烧杯（500mL）、pH7.2或pH8.0的0.01mol/L PBS等。
2、操作过程：
a.抗体的准备：取适量已知抗体浓度的溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为20mg/mL，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5~10min。
b.荧光素的准备：根据欲标记的蛋白总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
c.标记：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角瓶壁或搅拌玻璃棒上（大约5~10min内加完）。加毕后，继续搅拌12~18h。标记期间应保持蛋白溶液于4摄氏度冰箱或冰库中。
d.透析：标记完毕后，将标记的抗体溶液离心（2500rpm）20min，除去其中少量的沉淀物，装入透吸袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0~4摄氏度）过液。
e.过柱：取透析过液的标记物，过Focudex G-25或者Focudex G-50进行系体置换，然后分装、贮存于4摄氏度冰箱或冰库中。
FITC标记抗体的保存
以4摄氏度或-20摄氏度低温保存，防止抗体活性降低和蛋白质变性。最好加入浓度为（1:5000）~（1:10000）的硫柳汞或（1：1000）~（1:5000）的叠氮钠防腐，小量分装如0.1~1mL，真空干燥后更易长期保存。
FITC标记抗体的应用
1.免疫荧光技术
2.酶联免疫吸附（ELISA)
3.放射免疫测定
4.免疫印迹（western blot）
