荧光素按激发光波长来分,主要是激发波长为375nm、405nm、488nm和633nm四类。其中,常用的是激发波长为488nm和633nm的荧光素,如FITC、PE、APC、PI等。
激发波长为488nm的荧光素
1.异硫氰酸荧光素
Fluorescein isothiocyanate,FITC是应用较广的一种荧光素,经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光,发射波长为525nm。FITC的荧光强度受PH影响较大,常随着PH的降低而减弱。因此,在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。
2.藻红蛋白
Phycoerythrin,PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料,经激光激发后发出橙黄色荧光,发射波长为575nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点,可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中,PE标记的抗体适用于配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪。
3.Alexa Fluor
Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致,经激光激发后发出绿色荧光,发射波长为519 nm,但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说,Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
4.PE-Cy5
PE-Cy5是一种复合染料,属于藻红蛋白偶联物,在此类复合染料中,激发能量可从PE传递到Cy5上,发射波长为667nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围小,荧光干扰少,因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不适合与APC搭配使用,两者的光谱重叠范围大。
5.PE-Cy5.5
复合染料,能量从PE传递到Cy5.5上,发射波长为694nm。与PE-Cy5不同,PE-Cy5.5和APC之间的荧光干扰小,可搭配使用。并且,PE-Cy5.5的荧光强度要优于PE-Cy5。
6.PE-Cy7
复合染料,发射波长为785nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠,与APC重叠也较少,因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意,PE-Cy7的光淬灭性很强,需要避光环境。
7.PerCP-Cy5.5
复合染料,发射波长为695nm。PerCP的光量子产率较低,适用于表达水平较高蛋白的检测,而PerCP-Cy5.5光量子产率高,可用于表达水平较低蛋白的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时,需要做补偿调节,但比PerCP补偿少。
8.PI/7-AAD
碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的发射波长分别为617nm和647nm,常用于细胞凋亡检测。在大部分流式细胞仪上,PI在FL2或FL3通道检测,7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI有着相似的荧光特性,但其发射光谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的替代品。
激发波长为633nm的荧光素
1.别藻青蛋白
Allophycocyanin,APC发射波长为660nm,其标记的抗体适用于配备氦氖激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC是经典的3色搭配组合。
2.Cy5
Cy5属于小分子染料,发射波长为670nm,其标记的抗体适用于配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外,Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是,Cy5与单核细胞、粒细胞的非特异性结合多,实验结果容易出现假阳性。
3.Alexa Fluor 647
Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料,发射波长为668 nm,一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有光量子产率高、光稳定性好、适应的PH范围较广和不易淬灭等特点,是APC和Cy5的替代品。