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科研实验中的免疫标记技术-辣根过氧化物酶(HRP)标记

时间:2022-08-19    阅读:1364    点赞:0

常见的抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等,还有一些其他的标记方法例如金标记,星戈瑞简要介绍辣根过氧化物酶(HRP)标记:

 

辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基,加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合,形成Schiff氏碱。

 

为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合,在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了,用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。

 

方法:

(1)将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml,室温搅拌作用1小时,以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

(2)再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液,在室温中避光轻搅30分钟,溶液呈黄绿色;随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇,轻搅1小时,中止氧化反应。

(3)移入透析袋中,在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中,4℃透析过夜,更换三次缓冲液,注意避光。

(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml,加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml,室温轻搅2-3小时,避光;加入5mg NaBH4 ,4℃放置3小时或过夜,或换用乙醇胺(2mol/L PH9.5)0.2ml,作用7小时。

(5)再移入透析袋中,在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时,更换三次缓冲液。

(6)用3000r/min离心30分钟,除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次,沉淀用少许PBS溶解,透析或层析除盐,必要时进一步层析纯化。

(7)、(8)步骤同程序一。


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