荧光蛋白的改造工作主要集中于提高荧光蛋白的亮度,改变Stokes位移(指激发峰与发射峰之间的距离)和光谱特性,以及寻找新型光转换/光激活荧光蛋白等方面。下面介绍几种较为常用的绿色荧光蛋白基因及发光特性。
mGFP5:将野生型GFP的ser65替换为thr,荧光强度较野生型的GFP提高了4-6倍。GFP的激发光波长与紫外线区较为接近,对光学要求较高,不适宜作活细胞观察。改造后的mGFP5的激发光波长提高到488nm,位于青色区域,避免了上述缺点。目前这一突变体已被EGFP替换。
EGFP:在mGFP5的基础上将Phe64替换为Leu,得到的GFP突变体命名为EGFP。EGFP的生色团在37℃的荧光得到了很大的提高,荧光强度较野生型GFP提高了35倍,并且在激发后16-24小时后仍可稳定地检测到。当然,EGFP也有相应的缺陷,对pH较为敏感,易于二聚化。EGFP目前仍然是常用的绿色荧光蛋白。
D2EGFP:在EGFP的C端加入422-461氨基酸残基的小鼠鸟氨酸脱羧酶(MODC,mouse ornithine decarboxylase),得到一个不稳定的EGFP变体。MODC的422-461氨基酸残基区包含一个PEST序列,靶定目的蛋白降解,d2EGFP只有2小时的半衰期。
多色GFP变体:将接近GFP生色团的Thr203突变为Trp后,可以将激发光和发射光的波长均增加20nm,再进一步改造为黄色荧光蛋白EYFP。如果将GFP生色团中的Tyr66突变为His后得到蓝色和青色荧光蛋白变体BFP/CFP。这些变体或存在光漂白现象,或荧光强度不高,或对pH变化敏感等缺陷,需要进一步的改进优化。