彩色成像实验选择荧光蛋白的第一步是要知道什么荧光蛋白是可用的。随着更多新的荧光蛋白的发表，确定特定应用的荧光蛋白较为重要。
1.选择兼容的荧光蛋白
在选择一组荧光蛋白一起成像时，需要考虑与选择单个荧光蛋白相同的因素(亮度、光稳定性等；还需要选择可互相区分并与已有的成像系统相匹配的荧光蛋白。准确测定两种荧光蛋白是否可以相互分离，需要了解它们的激发和发射光谱。
2.荧光蛋白与光学显微镜是否兼容
需要将该蛋白质的激发和发射光谱与显微镜上的滤光器或激光器进行比较。在激发和发射滤光片和蛋白质的激发和发射光谱之间有重叠，这样蛋白质就能被显微镜很好地激发，蛋白质的荧光发射就能被显微镜有效地收集。
3.常用的过滤装置和相关荧光蛋白
用于多色成像的常用滤光片包括CFP，YFP和RFP或Sedat Quad滤光片，设计为DAPI /荧光素/罗丹明/ Cy5(例如Semrock’s)和类似的4-激光共焦组合(405 / 488 / 561 / 640 nm)。成像的较好的荧光蛋白是mTagBFP2，EGFP或改良GFP变体mRuby2或TagRfp -T，以及红外荧光蛋白，如iFP1.4或iFP2.0。
