荧光染料或探针是许多成像和诊断应用的理想选择。荧光多肽的应用范围从多肽到蛋白质相互作用的研究，酶活性测定，或开发新的疾病模型。荧光团可以共价连接到N端或c端，但建议结合到N端。FRET对，由受体和猝灭器组成，可以连接在内部或外部。对于较长的序列，建议使用FRET对的内部连接。
FITC标记多肽通常主要有两种形式：
（1）在整条肽链末端接入FITC，并且在FITC之前接入一分子的Acp（6-氨基己酸），也称烷基间隔器。反应中FITC与肽链上裸露的-NH2反应，Acp的接入提供了六个碳的直链空间，大大降低了反应的空间位阻，提高了反应效率，降低了反应难度。其次，FITC还与多肽结构中的-SH，侧链-NH2反应，Acp的加入也降低了这种副反应发生的可能。此外，多肽在酸性环境条件下切割时，在N端接入FITC的多肽需要经历环化作用来形成荧光素，这种过程通常都会伴随最后一个氨基酸的切除，而烷基间隔器Acp的接入就避免了这一情况的发生。
（2）在整条肽中的某个Lys侧链接入FITC，Lys侧链为末端为-NH2的四碳直链烷基，直接起到了降低空间位阻的作用。这种修饰方式能够灵活的在整条肽中任何位置进行FITC修饰，而不仅仅局限于末端。
